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ペプチドの末端アミノ基にジニトロフェニル基を結合させると黄色く着色することを利用し、タンパク質のアミノ酸配列を決定する方法を確立した（サンガー法）。この手法を用いてインスリンの一次構造の特定に初めて成功し、タンパク質がアミノ酸の連結したものであることを最終的に確定させた。この功績により1958年のノーベル化学賞を受賞。
1979年に、コロンビア大学よりルイザ・グロス・ホロウィッツ賞をウォルター・ギルバート（1980年ノーベル化学賞共同受賞者）と共に受賞。翌年の1980年には、ジデオキシヌクレオチドを用いたDNAの塩基配列の決定法（ジデオキシ法、こちらもサンガー法と呼ばれることが多い）の発明により、再びノーベル化学賞を受賞した（ノーベル化学賞を2度受賞したのはサンガーだけである）。なおサンガーはRNAの配列決定法も開発しており、これもノーベル賞級の実績とされていることから、史上初の個人のノーベル賞3度受賞に最も近い人物といわれる（団体としては 赤十字国際委員会:International Committee of the Red Cross (ICRC) がノーベル平和賞を3度受賞している）。